Пропустить навигацию.
Главная

В. В. Лысак М И К Р О Б И О Л О Г И Я ч 2

7.5.2. Конъюгация

Рекомбинация между донорной и реципиентной ДНК

Конъюгация - процесс генетического обмена, сопровождающийся переносом генетической информации от клетки донора к клетке-реципиенту, который осуществляется при непосредственном контакте клеток между собой.

Явление конъюгации было открыто Дж. Ледербергом и Э. Татумом в 1946 г. в экспериментах с полиауксотрофными штаммами бактерий E. coli. Они пытались доказать существование генетической рекомбинации у бактерий E. coli. Классический эксперимент Ледерберга и Татума заключался в следующем. Два ауксотрофных мутантных штамма E. coli со следующими генотипами:

штамм А - met- bio- thr+ leu+ thi+, штамм В - met+ bio+ thr- leu- thf выращивали в течение ночи в жидкой полноценной среде. Культуры обоих штаммов смешивали и инкубировали при оптимальных условиях в течение определенного промежутка времени. Затем смешанную культуру центрифугировали для того, чтобы отмыть клетки от полноценной среды, и высевали на агаризованную минимальную глюкозо-солевую среду. После инкубирования при температуре 37 °С на этой среде с частотой 10-6-10-7 сформировались колонии, клетки в которых имели генотип met+ bio+ thr+ leu+ thi+ (рис. 64).

солевая среда

1 .

Минимальная

>? ♦ А J

глюкозо-солевая среда

Рис. 64. Схематическое изображение классического опыта по скрещиванию ауксотрофных мутантов, проведенного Дж. Ледербергом и Э. Татумом

Для того чтобы доказать, что спонтанной реверсии исходных ауксо-трофных мутантов к прототрофности не наблюдалось, клетки штаммов А и В по отдельности также отмывали от полноценной среды и высевали на минимальную глюкозо-солевую среду. Такие спонтанные обратные мутации практически не могут осуществляться, поскольку для их возникновения необходимо, чтобы мутации произошли одновременно в двух генах штамма А и трех генах штамма В. Следует учитывать, что

спонтанные мутации от ауксотрофности к прототрофности обычно про 7

исходят с частотой 1-10 , а одновременная реверсия двух ауксотрофных признаков к прототрофности должна происходить с частотой порядка 110_14, трех _ 110_21. В экспериментах же Ледерберга и Татума при совместном посеве родительских штаммов на минимальную среду прото-трофные клоны появлялись с частотой приблизительно 10_6_10_7.

На основании полученных результатов Ледерберг и Татум сделали вывод, что прототрофы, образующиеся при смешивании культур, представляют собой генетические рекомбинанты. Иными словами, у таких прототрофов, по-видимому, произошло включение в геном генов met bio штамма В и генов thr leu thi штамма А:

1-----+----””i _ _

В met bio thr leu thi А met_ bio_\thr+_ leu+_th_C___\

К моменту проведения этого эксперимента уже была известна генетическая трансформация у пневмококков и было установлено, что она осуществляется бактериальной ДНК. Поэтому на первый взгляд казалось вероятным, что Ледерберг и Татум столкнулись всего лишь с другим случаем такой трансформации. Однако скоро выяснилось, что происхождение таких рекомбинантов нельзя объяснить трансформацией, так как Ледерберг и Татум показали, что для их появления необходим непосредственный контакт между бактериями штаммов А и В. Это было установлено следующим образом. Клетки одного из ауксотрофных штаммов (штамма А) обрабатывали стерильным фильтратом среды, в которой был выращен другой штамм (штамм В). Смесь высевали на минимальную глюкозо-солевую среду, инкубировали при температуре 37 °С, но прото-трофные клетки не образовывались, и даже в том случае, если клетки штамма В были разрушены непосредственно перед фильтрацией среды.

В 1949 г. Б. Дэвис получил дополнительные данные, подтверждающие результаты Дж. Ледерберга и Э. Татума о том, что для образования прототрофов необходим контакт родительских клеток. Б. Дэвис провел эксперимент в U-образной пробирке (рис. 65).

ш

г

Роста нет

Роста нет

Стеклянный фильтр

Минимальная глюкозо-солевая среда

Рис. 65. Схема эксперимента Б. Дэвиса

Минимальная глюкозо-солевая среда

Бактерии двух ауксотрофных штаммов А и В засевали в разные ветви U-образной пробирки, которые были разделены в нижней части пористым стеклянным фильтром, непроницаемым для клеток бактерий E.coli, но пропускающим частицы размером менее 0,1 мкм, а следовательно, и свободные молекулы ДНК. Повышая и понижая поочередно на одном из концов U-образной пробирки давление, Дэвис медленно перегонял культуральную жидкость из одной ветви в другую. В результате два ауксо-трофных штамма использовали одну и ту же питательную среду, но между клетками непосредственного контакта не было. При высеве бактерий на минимальную глюкозо-солевую среду ни в одной из ветвей U-образной пробирки прототрофы не были обнаружены. На основании полученных результатов был сделан вывод, что для образования рекомбинантов необходимо, чтобы клетки двух родительских штаммов пришли в физический контакт. Во время контакта происходит перенос генетической информации и в результате последующей рекомбинации формируются прототрофные трансконъюганты.

Дж. Ледерберг и Э. Татум полагали, что доля участия обоих родительских штаммов в образовании прототрофных клеток одинакова, т. е. что половой дифференциации у бактерий E. coli нет.

Однако позднее У. Хейс показал, что существуют бактерии мужского (доноры) и женского (реципиенты) типа и вклад их в конъюгацию не равнозначен. У. Хейс работал со штаммами Ледерберга и Татума, но в опытах дополнительно использовал признак стрептомицинустойчивости и один из скрещиваемых штаммов был устойчивым к этому антибиотику. Если штамм А являлся стрептомицинустойчивым, а штамм В - стреп-томицинчувствительным, то после их смешивания и совместного выращивания с последующим высевом на минимальную глюкозо-солевую среду со стрептомицином прототрофные колонии не формировались:

Штамм А: Штамм B: